Трансгенні організми — різні організми, які мають у складі свого геному чужорідні гени інших організмів та які отримують за допомогою методів генної інженерії.

Трансгенні тварини - це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетична інформація (трансген). Такою інформацією є або окрема ділянка ДНК зі своїми (>гомологичними) регуляторними послідовностями (>еукариотическаятранскрипционная одиниця), або сконструйований із різних молекул ДНК гібридний (>рекомбинантний) ген. Отже, трансген - це штучно запроваджений інтегрований в ДНК тварин чужорідний ген. Під трансгенезом розуміють процес перенесення і інтеграції чужорідної генетичної інформацією геном тварин.

На відміну від рослин, де існує можливість отримання цілої фертильної рослини з однієї трансформованої соматичної клітини і вегетативне розмноження, отримання трансгенних тварин - дуже складний і тривалий процес.

Використовувана стратегія полягає в наступному:

1. Клонований ген вводять в ядро заплідненої яйцеклітини.

2. Запліднені яйцеклітини з екзогенної ДНК імплантують в рецепієнтну жіночу особину (оскільки успішне завершення розвитку ембріона ссавців в інших умовах неможливо).

3. Відбирають нащадків, які розвинулися з імплантованих яйцеклітин, які містять клонований ген у всіх клітинах.

4. Схрещують тварин, які несуть клонований ген в клітках зародкової лінії, і отримують нову генетичну лінію.

 Експерименти по генетичній модифікації багатоклітинних організмів шляхом введення в них трансгенів вимагають багато часу. Проте, трансгеноз став потужним інструментом для дослідження молекулярних основ експресії генів ссавців і їх розвитку, для створення модельних систем, що дозволяють вивчати хвороби людини, а також для генетичної модифікації клітин молочних залоз тварин з метою отримання з молоком важливих для медицини білків. Був навіть запропонований новий термін «фармінг» (pharming), що відноситься до процесу отримання з молока трансгенних домашніх тварин автентичних білків людини або фармацевтичних препаратів.

Використання молока доцільно тому, що воно утворюється в організмі тварини у великій кількості і його можна надоювати у міру потреби без шкоди для тварини. Що виробляється молочною залозою і секретує в молоко новий білок, не повинен при цьому надавати ніяких побічних ефектів на нормальні фізіологічні процеси, що протікають в організмі трансгенної тварини, і піддаватися посттрансляційним змінам, які, принаймні, близькі до таких в клітинах людини. Крім того, його виділення з молока, яке містить і інші білки, не повинно становити великої праці.

Незважаючи на те, що перші трансгенні сільськогосподарські тварини були отримані в 1985 році введенням екзогенної ДНК в пронуклеус зигот, до теперішнього часу не розроблено ефективного методу, який би міг бути використаний для створення генетично модифікованих тварин незалежно від виду і від цілей експерименту. Розробка нових ефективних методів переносу генів в ембріональні і соматичні клітини тварин, а також вдосконалення існуючих підходів залишається актуальним завданням.

Серед великої різноманітності способів впровадження екзогенної ДНК в геном тварини можна виділити наступні, які знайшли широке застосування в практиці трансгенозу:

 - метод мікроін`єкції,

 - опосередковане ретровірусами перенесення генів,

 - використання модфікованих ембріональних стовбурових клітин, - перенесення трансформованих ядер генеративних і соматичних клітин,

 - використання сперміїв і сперматогоніїв як переносників ДНК.

 Серед інших способів доставки екзогенної ДНК в організм тварин можна відзначити використання ліпосом, аденовірусних векторів, а також метод високошвидкісний ін`єкції. Однак ці методи не знайшли широкого застосування внаслідок їх недостатньої стабільності, а також відсутності інтеграції трансгенів в геном.

Мікроін`єкції рекомбінантної ДНК в запліднені ооцита багатоклітинних тварин поки залишаються найбільш популярним способом введення чужих генів в організм тварин. Незважаючи на те, що метод вимагає високої кваліфікації і дорогого устаткування, простота і надійність окупають всі його недоліки. Першою і найбільш добре розробленої експериментальної системою для отримання трансгенних тварин з`явилася миша. Донорних самок мишей з експериментальною суперовуляцією схрещують з самцями-виробниками, через 12 годин виділяють запліднені яйцеклітини і поміщають їх в культуру. Далі в  двох пронуклеусів (зазвичай чоловічий) ін`єктують рекомбінантну ДНК (рис. 1.). Ті, що пережили ін`єкцію яйцеклітини пересаджують самкам-реципієнтам. Тільки частина трансплантованих ооцитів продовжує розвиватися до народження дитинчат.

 Мал. 1.. Мікроін`єкція екзогенної ДНК в пронуклеус заплідненої яйцеклітини ссавців під мікроскопом (а) і схема експерименту (б)

На частоту інтеграції екзогенної ДНК при використанні методу мікроін`єкції впливають такі фактори, як чистота введення зразка, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину для мікроін`єкції, якість ембріонів, а також спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (не хірургічний, хірургічний, ). Трансгенних тварин в потомстві ідентифікують різними методами, найчастіше ПЕГ, і схрещують для отримання трансгенних ліній. Деякі з трансгенних тварин виявляються мозаїчними (статеві клітини не містять екзогенної ДНК), тому при схрещуванні трансгенним виявляється менша частина потомства першого покоління, ніж розрахункові 50%. У ряді випадків гомозиготні лінії отримати не вдається, оскільки 5-15% трансгенних інсерцій в гомозиготному стані летальні, так як інсерція іноді порушує життєво-важливі частини геному. Точний механізм, що забезпечує інтеграцію  ДНК в хромосоми клітки-мішені, невідомий, однак аналіз структури вбудованої ДНК дозволяє виявити деякі моменти. Інтеграція відбувається випадковим чином в один хромосомний локус, який може містити від одного до декількох тисяч тандемних копій інтегрованої ДНК. Близько 30% отриманих первинних трансгенних тварин, як правило, виявляють ту чи іншу ступінь мозаїчності, що може бути наслідком інтеграції екзогенної ДНК після завершення першого циклу реплікації.

Ретровірусні вектори також використовуються для отримання трансгенних тварин. Інфікування пре- імплантаційних ембріонів рекомбінантними ретровирусами - відносно нескладна ефективна процедура.

Восьмиклітину морулу (рис. 2.) звільняють від яйцевої оболонки і поміщають в культуральну чашку з фібробластами, що продукують рекомбінантний ретровірус. Інфіковані ембріони, які досягли стадії бластули, імплантують псевдовагітність самкам. В результаті формуються трансгенні організми, мозаїчні за кількістю і локалізації вбудованої  рекомбінантної ДНК в геном. Тому для отримання чистих ліній далі необхідний масштабний аутбридинг. Недоліком методу є обмеження вставки екзогенної ДНК ~ 8 тнп, внаслідок чого трансгеи може виявитися позбавленим прилеглих регуляторних послідовностей, необхідних для його експресії, а в деяких випадках інтеграція в вихідному локусі нестабільна.

 Використання ретровірусних векторів має і ще один великий недолік. Хоча ці вектори створюються так, щоб вони були дефектними по реплікації, геном штаму ретровірусу (вірусу-помічника), який необхідний для отримання великої кількості векторної ДНК, може потрапити в теж ядро, що і транс гени. Незважаючи на всі вжиті заходи, ретровіруси-помічники можуть репікуватися в організмі трансгенної тварини, що абсолютно неприпустимо, якщо цих тварин передбачається використовувати в їжу або як інструмент для отримання комерційного продукту. І оскільки існують альтернативні методи трансгенозу, ретровірусних вектори рідко використовуються для створення трансгенних тварин, що мають комерційну цінність.

 Мал. 2. Схема отримання лінії трансгенних мишей з використанням ретровірусних векторів.

Модифіковані ембріональні стовбурові клітини можуть бути використані для отримання трансгенних тварин. Клітини, виділені з мишачих ембріонів на стадії бластоцисти, можуть проліферуватися  в культурі, зберігаючи здатність до диференціювання в будь-які типи клітин, в тому числі і в клітини зародкової лінії, при введенні в інший ембріон на стадії бластоцисти (рис. 3.). Такі клітини називаються плюрипотентними ембріональними стовбуровими клітинами (ES). У ES-клітини в культурі можна ввести цільові трансгени різними методами (трансфекція, електропорація, ретровірусна інфекція і т.д.) без порушення їх плюрипотентності.

Практична цінність цієї схеми полягає в тому, що вона дає великі можливості для проведення селекції клітин за певним параметру. Це може бути число копій трансгену, його локалізація або характер експресії. Знаючи послідовності, що оточують конкретний сайт для бажаної інтеграції, можна сконструювати вектор для вбудовування цільової ДНК шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, замінити який не-будь ген, що кодує легко ідентифіковану ознаку з метою селекції, прибравши або відновивши його функцію в отриманої трансгенної клітці. Таким же чином отримують так званих нокаутних мишей (knock out) - мишей з направлено інактивованим певним клітинним геном для дослідження його функцій. Для здійснення гомологічной рекомбінації вектор конструюють з фрагментів цільового гена, який планується інактивувати, частина цільового гена при цьому замінюється будь-яким селективним маркером для проведення відбору клітин з інтегрованою конструкцією.

Мал. 3. Отримання трансгенних мишей методом реконструкції ембріонів за допомогою генетично модифікованих ембріональних стовбурових клітин (ES-клітин).

ES-клітини отримують з внутрішньої клітинної маси бластоцисти миші. Відібрані трансгенні ES-клітини можна культивувати і використовувати для отримання трансгенних тварин. Це дозволяє уникнути випадкового вбудовування трансгенів, характерного для методу мікроін`єкцій і ретровірусних векторних систем.

Перенесення ядер трансформованих генеративних і соматичних клітин в яйцеклітину, або соматичні ядерні перенесення (somatic nuclear transfer), ще один спосіб, який використовується в практиці трансгенозу. Було показано, що ядра ембріональних клітин різних тварин при перенесенні в енуклейовану яйцеклітину іноді здатні забезпечувати розвиток цілого нового організму. Після нетривалого культивування навіть ядра з деяких диференційованих клітин здатні забезпечувати розвиток до життєздатної особини. Так, наприклад, знаменита овечка Доллі була клонована в 1997 році злиттям культивованих (3-6 пасажів) клітин епітелію молочної залози (вимені) дорослої шестирічнї тваринної з позбавленої ядра яйцеклітиною (рис. 4.). Хоча не можна виключити, що для клонування випадково була взята недиференційована клітина, яка присутня в донорському епітелії.

Мал. 4. Клонування вівці методом перенесення ядра. Епітеліальні клітини молочної залози в культурі індукують для переходу в фазу G0 (стадія, на якій знаходиться яйцеклітина). Потім здійснюють злиття такої клітини з енуклейованою яйцеклітиною і вирощують ембріони до ранніх стадій ембріогенезу. Після чого ембріони імплантують в матку сурогатної матері, де відбувається подальший розвиток. В експерименті Я. Уілмут (I. Wilmut) з клонування Доллі було проведено 277 злиттів без`ядерних яйцеклітин з клітинами молочної залози у фазі G0, з 29 тих, що вижили ембріонів тільки один розвинувся до життєздатного організму.

Клонування Доллі з ядра диференційованої клітини і трьох інших овець з ядер ембріональних клітин вдалося здійснити завдяки перенесенню ядер з клітин, що знаходяться в стадії спокою (G0), і, можливо, особливостям ембріогенезу цієї тварини. У зиготах овець протягом перших трьох поділів, що займають кілька діб, відбувається тільки реплікація ДНК, жоден з генів не експресується. Передбачається, що за цей час введена ДНК звільняється від специфічних для клітини регуляторних білків, а відповідні гени ембріонального розвитку зв`язуються з ініціаторними ембріональними білковими факторами з цитоплазми яйцеклітини.

Основна проблема, яку потрібно вирішити для того, щоб створення будь-яких трансгенних тварин за допомогою методу перенесення ядер стало реальним, - це збереження плюрипотентності клітин в безперервній культурі. В даний час ведуться активні пошуки факторів репрограмування диференційованих клітин для індукції плюрипотентності. Якщо це вдасться, то генетична зміна таких клітин і створення трансгенних організмів шляхом соматичного ядерного переносу стане майже рутинною процедурою, а поки це одиничні вдалі експерименти.

 Штучні хромосоми як трансгенний вектор. 

Більшість трансгенів є кДНК, невеликі гени (lt; 20 тнв) або фрагменти генів. Найчастіше кДНК погано експресуються в клітинах ссавців, а коли трансгеном служить геномна ДНК, важливі геноспецифічні регуляторні послідовності, розташовані до і після гена-мішені, зазвичай не входять до складу вставки. Крім того, повнорозмірні гени і мультігенні комплекси (gt; 100 тнв) занадто великі для вбудовування в звичайні вектори. З огляду на все це, для трансгенозу стали використовувати штучні дріжджові хромосоми (YAC), що вміщають фрагменти геномної ДНК довжиною від 100 до gt; 1 000 тнв і штучні хромосоми людини ще більшої місткості (про штучні хромосомах). Дані епісомальні вектори мають ще одну перевагу - дозволяють уникнути ефект положення гена при експресії екзогенної ДНК. Рівень експресії вбудованого гена дуже залежить від його хромосомної позиції, наприклад, вбудовування в неактивний хроматин (гетерохроматин) інактивної хромосоми призводить до інактивації гена. За допомогою штучних дріжджових хромосом (YAC), несучих кілька споріднених генів або один великий ген, були отримані трансгенні миші шляхом мікроін`єкції в пронуклеус заплідненої яйцеклітини або трансфекцією ES-клітин.

 За допомогою YAC-трансгенозу були отримані миші, які синтезували тільки людські антитіла, які є складною тетрамерной конструкцією з двох пар різних поліпептидних ланцюгів. Штучні хромосоми людини (human artificial chromosome -HAC), що містять цілком іммуноглобуліновий локус людини з важкими і легкими ланцюгами, були впроваджені в бичачі фібробласти, які потім використовували для соматичного ядерного переносу. Отримані трансхромосомні телята експресували імуноглобуліни людини в своїй крові. Ця система стала важливим кроком в напрямку тваринної продукції терапевтичних поліклональних антитіл людини. Подальші спостереження за трансгенними тваринами показали, що рекомбінантні HACs підтримувалися в більшості особин першого покоління протягом декількох років.

 Чи будуть отримані штучні хромосоми відповідним чином розділятися в процесі мейозу і успадковуватися, ще тільки належить з`ясувати. Зовсім недавно з`явилася нова перспективна технологія для отримання тварин з вимкненими генами - малі інтерферуючі РНК (міРНК, siRNA), які використовують для прицільного виключення генів (сайленсінг). 

РНК-інтерференція - консервативний посттранскрипційний регуляторний процес. Дволанцюжкові малі інтерферуючі міРНК в 19-23 нуклеотиду специфічно зв`язуються з комплементарної послідовністю своєї матричної мРНК-мішені, направляючи її по шляху деградації.

Незважаючи на розроблений широкий спектр методик отримання трансгенних тварин, в даний час поки відсутня надійна і ефективна технологія трансгенозу тварин. Найбільші проблеми пов`язані з безладним вбудовуванням екзогенної ДНК в геном при використанні більшості існуючих методів. Так що подальші якісні поліпшення технології необхідні в області розробки прицільної модифікації клітинних генів і точного вбудовування екзогенної ДНК в геном.